بررسی امکان تهیه مارکر ژنتیکی(Luciferase gene)جهت نشان دار کردن و رد یابی بچه ماهیان سفید يا كپور معمولي بعنوان شاخص زيستي1392

برای اجرای این پروزه جهت دستیابی به ژن لوسیفراز از باکتری ویبریوفیشری استفاده گردید. برای این منظور باکتری مورد نظراز سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران تهیه گردید. پس ازکشت درمحیط اختصاصی، DNA ژنومی باکتری به روش فنل – کلروفرم استخراج شد. جهت تکثیر ژن های LuxA و LuxB از پرایمرهای اختصاصی که جایگاه های هضم آنزیمی KpnI و BamHI درسمت '5 آن تعبیه شده بوده ، استفاده گردید. محصول PCR پس ازخالص سازی درپلاسمید PT257R کلون گردید و سپس به سلولهای Ecoli منتقل شد. تائید کلون های نوترکیب به روش PCR بارایمرهای اختصاصی و هضم آنزیمی انجام گرفت. پس از تائید، قطعات LuxA و LuxB بترتیب در وکتور بیانی PcDNA3.1\hug و PcDNA3.1\neo کلون و جهت تائید آن از واکنش PCR با پرایمرهای اختصاصی و همچنین واکنش هضم آنزیمی استفاده شد. در نهایت پس از تائید، پلاسمیدهای نوترکیب PcDNA3.1\hug و PcDNA3.1\neo با استفاده از کیت اختصاصی به سلولهای یوکاریوتی NIH3T3 منتقل شدند. جهت بررسی توانایی نورزائی سازه های ژنتیکی تهیه شده، از کشت سلولهای NIH3T3 در حضور دکانال (بعنوان سوبسترا ) و غلظت های مختلف آنتی بیوتیک نئومایسین وهیگرومایسین استفاده شد. نتایج نشان داد که پس ازگذشت 2 ساعت ازاضافه شدن سوبسترا، واکنش نورزائی آغاز می شود و بتدریج با رسیدن به زمان 6 ساعت، میزان نورزائی افزایش قابل ملاحظه ای می یابد. علاوه برموارد فوق جهت تائید بیان و تولید پروتئین لوسی فراز، از روش SDS-PAGE و وسترن بلات استفاده شد که ایجاد باند پروتئین 76کیلودالتونی، موید صحت آزمایشات می باشد.