بررسی هتروژنیسیته در Leishmania tropica عامل لیشمانیوز پوستی و Leishmania infantum عامل لیشمانیوز احشایی در جنوب ایران

مقئمه: این پروژه به مطالعه تعیین ساختار ژنتیکی جمعیت و ژنوتایپینگ ایزوله های ایجاد کننده لیشمانیوز پوستی نوع شهری در منطقه بم و شهر کرمان به عنوان کانونهای اصلی جنوب شرق ( و ایزوله هایی از شهر شیراز به عنوان کانون لیشمانیوز پوستی انتروپونتیک در جنوب غرب ایران) با روشهای مولکولی میپردازد. روش کار: مطالعه مولکولی ایزوله های لیشمانیا تروپیکا وجود الگوی الکتروفورزی دو باندی را برای ژن ITS در مقایسه با الگوی تک باندی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا اینفانتوم نشان داد. آنالیز سکانسهای موجود در بانک ژن دو گروه از سکانسها ی متفاوت از نظر سایز را نشان داد که این تفاوت به خاطر یک شکاف به طول 100 نوکلوتید در داخل یک گروه از آنها بود. بنابر این یک پرایمر معکوس جدید به نام LITS- MG طراحی گردید که با تکثیر قطعه جدید،بخش حاوی شکاف از قطعه ITS حذف گردد.مطالعه ژنوتایپینگ بر روی ایزوله های متفاوتی از انگل لیشمانیا تروپیکا انجام شد که شامل 61 ایزوله جمع آوری شده از نقاط مختلف جغرافیایی و 26 ایزوله از اشکال کلینیکی کمیاب شامل فرمهای شکست درمان، مقاوم به درمان، لوپوئید، عود و اسپروتریکوئید می باشند. ژن های ITS-rDNA و kinetoplastid-minicircles به ترتیب با متد های سکونسینگ و هضم آنزیمی مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج: استفاده از پرایمر LITS-MG همانطور که بر اساس نتایج آنالیز نرم افزاری نیزقابل بیش بینی بود منجر به ایجاد قطعه تک باندی برای لیشمانیا تروپیکا گردید که برای کارهای بعدی همچون سکونسینگ مناسب است. ژنوتایپینگ ایزوله های لیشمانیا تروپیکا بر اساس نتایج حاصل از سکونسینگ ژن ITS-rDNA ، وجود 3 و 4 هاپلوتایپ رابه ترتیب در میان ایزوله های اشکال بالینی کمیاب و ایزوله های بدست امده از مناطق جغرافیایی مختلف نشان داد. هاپلوتایپ A ژنوتایپ غالب در میان این ایزوله ها بود.بیشتر تغییرات در منطقه ITS1 و همگی از نوع پلی مرفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) بودند. توپولوژی درخت بدست امده بر اساس متدهای ماکزیمم پارزیمونی و نیبور جوینینگ تقریبا مشابه بود. بر اساس نتایج بدست آمده از آنالیز سکانسهای ITS، ساختار جمعیتی لیشمانیا تروپیکا بدست آمده از جنوب شرقی کشور همولوگ می باشد. مطالعه توپولوژی درخت فیلوژنی نشان داد که ایزولهای جنوب ایران و هند قرابت بیشتری در مقایسه با سایر ایزوله های آفریقا و آسیا داشتند. در میان ایزوله های فرم های کلینیکی کمیاب تمام ایزوله ها به جز یک ایزوله از فرم لوپوئید (هاپلوتایپ L ) و یک ایزوله از فرم مقاوم به درمان (هاپلوتایپ R ) از هاپلوتایپ نوع A بودند. بر اساس نتایج هضم آنزیمی ژن kDNA-minicircles توسط آنزیم های Cla I و Msp I به ترتیب 24 و 34 ژنوتایپ در میان 39 ایزوله از مناطق مختلف جغرافیایی بدست آمد. بر اساس توپولوژی بدست آمده، ایزوله های شیراز به طور واضحی کلاستر جداگانه ای از نمونه های جنوب شرقی ایجاد نمودند. ایزوله های بدست آمده از فرمهای کمیاب توسط آنزیم Msp I مورد هضم قرار گرفت و 22 ژنوتایپ متفاوت حاصل شد. بر اساس توپولوژی بدست آمده، 3 ایزوله از 5 ایزوله اسپروتریکوئید تشکیل یک کلاستر را دادند. نتیجه گیری: حد اقل دو آلل درمنطقه ITS لیشمانیا تروپیکا نشان داده شد که در نمونه های بم مورد تایید قرار گرفت. وجود یک قطعه 100 نوکلئوتیدی در یک الل ممکن است یافته های گذشته در مورد ریکامبینیشن در لیشمانیا تروپیکا را تقویت نماید. لیشمانیا تروپیکای جنوب شرقی ایران یک ساختار جمعیتی همولوگ را تشکیل می دهد که از قرابت نزدیکی با سکانسهای هند برخوردار است. بر اساس نتایج kDNA-RFLP تعداد ژنوتایپ متعددی در میان ایزوله های لیشمانیا تروپیکا بدست آمد که به خاطر قدرت تفکیک بالای ژن کینتوپلاستی در مقایسه با ژن ITS می باشد. قرارگرفتن ایزوله های بدست آمده از کانونهای جنوب شرقی در کلاسترهای مستقل از نمونه های شیراز بر اساس هضم آنزیمی ژن kDNA، همولوگ بودن جمعیت لیشمانیا تروپیکای جنوب شرقی ایران را تایید کرد.