شناسایی جنس کرمهای خانواده تریکواسترونژیلوئیده در روده کوچک و شیردان نشخوار کنندگان کوچک بومی کشتار شده در کشتارگاههای استان ک

مقدمه: عفونت های انگلی یک مشکل بزرگ بهداشتی در سرتاسر جهان و بخصوص در کشور های در حال توسعه محسوب می‏شوند. در میان نماتود‏های دستگاه گوارش، جنس تریکوسترونژیلوس که شامل هشت گونه می باشد، به جهت زئونوز بودن و گسترش جهانی دارای اهمیت پزشکی و اقتصادی می باشد. همچنین گزارش های متعدد آلودگی دامی و انسانی با گونه‏های مختلف این جنس در ایران در مقایسه با سایر نقاط دنیا که آن را یکی از مهمترین کانون‏های آلودگی با این کرم در دنیا مبدل ساخته است، اهمیت و لزوم توجه بیشتر به این بیماری انگلی را دوچندان می‏سازد. در این مطالعه برای اولین بار، با روش سکونسینگ ژن ITS2 ، گونه های موجود احتمالی در ایزوله های جنس تریکواسترونژیلوس بدست آمده از شیردان و روده کوچک دامهای کوچک کشتار شده در کشتارگاههای سه شهرستان بویراحمد، کهگیلویه و گچساران به عنوان مراکز بزرگ دامپروری در استان کهگیلویه و بویراحمد را شناسایی و سویه های موجود در این گونه ها را با یکدیگر و سایر سکانسهای موجود در GenBank مقایسه نمودیم. بدین ترتیب علاوه بر تعیین گونه های موجود در استان، به بررسی ساختار فایلوژنتیک ایزوله های موجود در استان در مقایسه با سکانس های موجود از سایر نقاط ایران و جهان پرداخته شد. روش کار: مجموعا روده کوچک و شیردان 60 بز و گوسفند (از هر شهرستان 10بز و 10 گوسفند) در سه شهرستان کهگیلویه، گچساران و بویراحمد بررسی شد. جنس و گونه های تریکواسترونژیلوس از خانواده تریکوسترونژیلیده پس از بررسی مرفومتریک و مرفولوژیک از میان ایزوله های جدا شده تشخیص اولیه داده شد. نمونه های تریکواسترونژیلوس به الکل 70% منتقل و پس از استخراج DNA به روش فنل کلروفرم، تکثیر لوکوس ITS2 ژن ریبوزومال با روش PCR و به وسیله پرایمرهای NC1 و NC2 انجام و محصول برای سکونسینگ فرستاده شدند. نتایج حاصل از توالی یابی لوکوس ITS2 نمونه های مورد مطالعه با سکانس های ثبت شده موجود در GenBank با استفاده از نرم افزار BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) مقایسه و بدینوسیله گونه انگل تعیین و تایید گردید. پس از آماده سازی (trimming) سکانسها بوسیله نرم افزار Geneious ، درخت فیلوژنتیک بر اساس مدل maximum likelihood برای سکانس های بدست آمده در این مطالعه و سکانس های تریکوسترونژیلوس سایر مناطق ایران و دیگر کشورها ثبت شده در GenBank با کمک نرم افزار MEGA 6 رسم گردید. درخت حداقل 1000 بار توسط نرم افزار تولید شد (bootstrap 1000). نتایج: از مجموع 2000 نماتود روده ای جدا شده از روده و شیردان دامهای کوچک، 35 ایزوله تریکواسترونژیلوس جدا شد که همگی گونه تریکواسترونژیلوس ویترینوس بودند که 1 ایزوله از روده و12 ایزوله از شیردان گوسفندان (30 راس) و 17 ایزوله از روده بز و 5 ایزوله از شیردان بزها (30 راس) جدا شدند که از این تعداد 8، 17 و 10ایزوله به ترتیب از کشتارگاههای یاسوج، گچساران و دهدشت جدا سازی شدند. تمام ایزوله های بدست امده باند سایز321 جفت باز را با تکثیر قطعه ITS-2 ژن rDNA نشان دادند. 16 هاپلوتایپ ITS-2 در مجموع 35 ایزوله یافت شد. که به ترتیب از هاپلوتایپ 1 تا 16 نام گذاری شدند. که بیشترین فراوانی مربوط به هاپلوتایپ 1 (7 مورد ) و به ترتیب هاپلوتایپ های 2 و 3 (4 ایزوله) و 4 و 5 (3 ایزوله ) بود. هاپلوتایپ های 6،7 و 8 هر کدام شامل 2 ایزوله و هاپلوتایپ 9 الی 16 هر کدام شامل 1 ایزوله بود. بیشترین تغییرات در بخش ابتدایی 5 پریم بود. تمام تغییرات از نوع SNP بود. در بین ایزوله های جدا شده از کانون گچساران هاپلوتایپ های 1 تا 7، 10، 12 و 16 گزارش شد. همچنین در نمونه های دهدشت، هاپلوتایپ های 1 تا 4 و 6 تا 9، 11 و 14 مشاهده شد. هاپلوتایپ های 1، 2، 6، 10، 13 و 15 نیز از یاسوج گزارش شد. هاپلوتایپ های 1، 2 و 6 در هر سه کانون مشترک بودند. با توجه به کوتاه تربودن تعدادی از هاپلوتایپ های موجود در بانک ژن تمام سکانس تایپ های موجود هم اندازه شد و نهایتا یک قطعه 170 نوکلئوتیدی به دست امد. بر اساس پلی مرفیسم موجود در این قطعه 4 هاپلوتایپ در مجموع ایزوله های استان کهگیلویه و بویراحمد بدست امد که از A تا D نامگذاری شد. هاپلوتایپ های A، B و C در هر 3 کانون یاسوج، گچساران و دهدشت دیده شد اما هاپلوتایپ D صرفا ازگچساران گزارش شد. هاپلوتایپ های B و D بیشترین تفاوت (0.018%) را داشتند. . بر اساس توپولوژی دو کلاد اصلی A و B در درخت فایلوژنتیک وجود داشت. کلاد A شامل ایزوله های روسیه، گیلان، اردبیل، خوزستان و هاپلوتایپ های کهگیلویه وبویراحمد از ایران، اسکاتلند، بریتانیا، استرالیا و زلاند نو بود. کلاد B از ایزوله های تریکواسترونژیلوس از افریقای جنوبی تشکیل شده بود. در کلاد A یک زیر کلاد وجود دارد و شامل ایزوله هایی از کهگیلویه و بویراحمد، زلاند نو و بریتانیا بود اما عمده ایزوله ها در کلاد A درموقعیت فیلوژنتیک مشابه و از کهگیلویه و بویراحمد، گیلان، اردبیل، روسیه، زلاند نو، استرالیا و اسکاتلند بودند. همچنین یک ایزوله از خوزستان به صورت یک تاکسای مجزا در بخش اصلی کلاد A قرار گرفت. نتیجه گیری: احتمالا به علت مقاومت بیشتر گونه تریکواسترونژیلوس ویترینوس در برابر مواجهه با دوزهای بالاتر داروها با توجه به مصرف بیش از حد داروهای ضد انگلی توسط دامداران در استان وهمچنین مقاومت محیطی بیشتر در این گونه (رشد لارو در دمای زیر 8 درجه سانتیگراد) در مقایسه با سایر گونه ها منجر به رشد منحصر این گونه در دامهای استان شده است. از نظر ژنتیکی به نظر می رسد توزیع هاپلوتایپ ها در استان وابسته به مناطق جغرافیایی مختلف با ویژگی های جغرافیایی متفاوت نمی باشد. شباهت زیاد سکونس تایپ های روسیه و استانهای شمال ایران بر اساس نزدیکی جغرافیایی قابل توجیه است. توزیع نمونه های استرالیا، نیوزلند، اسکاتلند و انگلستان در موقعیت های متفاوت در کلادA که همگی مربوط به کشورهایی هستند که چند صد سال مدیریت سیاسی واحدی داشته اند (royal society) با توجه به تفاوت جغرافیایی و فاصله زیاد کشورهای ذکر شده قابل توجیه است. پادشاهی متحده (UK) از بزرگترین تولید کنندگان و صادر کنندگان دامها در جهان بوده است. در قرن 19 و 20 این کشور در جنوب ایران حضور فعال داشته است. به نظر می رسد توزیع هاپلوتایپ های استان کهگیلویه و بویراحمد در هر دو موقعیت در کلاد A به علت نقل و انتقالات دامها و تماس با دامها و یا ایزوله های وارد شده به این نقطه از جنوب ایران و احتمالا از طریق حضور و فعالیتها بریتانیا باشد. مطالعه مشابه در استانهای فارس و بوشهر برای مقایسه انجام نشده است. نتایج این مطالعه منجر به ایجاد دیتابیس های ژنتیکی قابل استفاده به منظور هر گونه تحقیق در زمینه تغییرات اپیدمیولوژیک اینده در استان و ایران می باشد. به علاوه این مطالعه برای اولین بار به بررسی موقعیت فایلوژنتیک ایزوله های گونه تریکو استرونژیلوس ویترینوس از نقاط مختلف جهان پرداخت.