ارزیابی روش الایزا نقطه ای با استفاده از آنتی ژن نوترکیب سطحی مروزوآیت پلاسمودیوم ویواکس 42 PvMSP-1 و مقایسه آن با روش لام میکروسکوپی 1393

تست های سرولوژیکی در تشخیص پلاسمودیوم ویواکس در تحقیقات اپیدمیولوژیکی ، تشخیص عفونت انسانی و غربالگری افراد اهدا کننده خون در نواحی اندمیک و غیر اندمیک می¬تواند یک وسیله و ابزار با ارزش محسوب گردد. از آنجایی که پلاسمودیوم ویواکس را نمی¬توان به راحتی در محیط In vitro کشت داد، تست¬های سرولوژیکی با استفاده از پروتئین¬های نوترکیب خالص و یا نیمه خالص متداول گشته است. چندین آنتی¬ژن به عنوان کاندید در پلاسمودیوم ویواکس تا به حال پیش نهاد شده، که دارای قابلیت تشخیصی در تست¬های سرولوژیکی بوده اند . ناحیه C-terminal آنتی¬ژن PvMSP-1 یکی از این کاندیداها به شمار می¬رود که در سطح مروزوئیت به عنوان یک پروتئین با بیان بالا مطرح است. در این تحقیق این چنین بررسی شد که آیا آنتی ژن نوترکیب PvMSP-1 42 در افراد آلوده با این انگل می¬تواند درتشخیص آنتی¬بادی¬های ضد P. vivax توسط تست سرولوژیکی الایزا نقطه¬ای مفید باشد. مواد و روش¬ها: تکثیر ژنی از DNA استخراج شده انجام شد. و برای انجام کلونینگ ، پلاسمید pTZ57R مورد استفاده قرار گرفت. سپس از فرم خطی شده این پلاسمید در تهیه T-overhangs استفاده گردید و متعاقبا لایگیشن صورت پذیرفت. سپس محصولات لایگیت شده به باکتری E. coli سویه Top 10ترانسفورم گردید و کلونی¬های مثبت مشکوک توسط دو تست PCR و هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفتند و یکی از آن¬ها در نهایت تعیین توالی گردید. پلاسمید¬های نوترکیب از باکتری¬ها استخراج و برای جدا کردن مجدد ژن از آنها مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. این بار ژن جدا شده در وکتور بیانی PGEX 6P1 ساب کلون گردید و در باکتری E. coli سویه BL21 ترانسفورم گردید. پس از تائید ترانسفورم توسط تست¬های ‏PCR‏ و هضم آنزیمی ‏، باکتری¬های حامل ژن نوترکیب در محیط LB مایع که به آنها در فاز لگاریتمی IPTG افزوده شده بود، کشت داده شدند. سپس بیان پروتئین در آنها توسط SDS PAGE مورد تائید قرار گرفت و بعد از آن پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی جذبی گلوتاتیون سفارز خالص گردید و میزان بیان پروتئین توسط روش برادفورد مورد ارزیابی قرار گرفت. تست وسترن بلات برای ارزیابی توانایی پروتئین مزبور در واکنش با آنتی¬بادی¬های موجود در سرم¬های انسانی افراد آلوده با پلاسمودیوم ویواکس انجام شد. و در نهایت پروتئین نوترکیب خالص شده به عنوان آنتی¬ژن کوت¬کننده در تست های الایزا و الایزای نقطه¬ای مورد استفاده قرار گرفت. روش¬های سرولوژیکی الایزا و الایزای نقطه¬ای برای تشخیص عفونت پلاسمودیوم ویواکس با یکدیگر مورد مقایسه قرار گرفتند. این مقایسه نسبت به 84 سرم از افراد آلوده به این انگل در مناطق اندمیک که عفونت در خون آنها توسط آزمایش استاندارد میکروسکپی تائید شده بود و 84 نمونه به عنوان کنترل منفی که شامل 69 نفر از افراد سالم ساکن مناطق اندمیک ، 12 سرم از افراد آلوده به سایر بیماری¬های عفونی در مناطق غیر آندمیک و 3 سرم از افراد آلوده به پلاسمودیوم فالسیپاروم بود، انجام گردید. یافته ها: توالی ژن نوترکیب PvMSP-142 به وضوح بیانگر 95٪ همولوژی با ژن همولوگ رفرانس Sal-I و 97٪ همولوژی با ژن¬های همولوگ آن در ژاپن و هند بود. 38 پلی¬مورفیسم تک نقطه¬ای در ژن نوترکیب یافت شد که همگی در قطعه 33 کیلو دالتونی واقع بود و تقریبا هیچ موتاسیونی در قسمت 19 کیلو دالتونی مشاهده نگردید. 2 تا از 38 موتاسیون نسبت به همولوگ هایش در جهان کاملا جدید بود. آزمون وسترن بلات نشان داد که پروتئین نوترکیب فیوژن قادر به واکنش با سرم¬ افراد آلوده بوده ولی هیچ واکنشی نسبت به سرم های کنترل منفی از خود نشان نداد. در این مطالعه نیز آزمایش میکروسکپی به عنوان گلد استاندارد استفاده شد. عیار Cut-off برای تست الایزا معادل 388/0 OD= تعیین شد آنالیز کامل داده ها نشان داد که میزان حساسیت و ویژگی تست الایزا را به ترتیب معادل (9/86 ٪) و (05/94٪) بدست آمد. همچنین میزان ارزش اخباری مثبت و منفی و اعتبار تست به ترتیب معادل ( ‏58/93‏٪)، (‏77/87‏٪) و (‏47/90٪) بدست آمد. از طرف دیگر میزان حساسیت و ویژگی تست الایزای نقطه¬ای را به ترتیب معادل (85/92 ٪) و (28/89٪) بدست آمد. همچنین میزان ارزش اخباری مثبت و منفی و اعتبار تست به ترتیب معادل( ‏65/89 ‏٪)، (‏59/92‏٪) و(‏06/91‏٪) بدست آمد .