مقطع : کارشناسی ارشد
دانشگاه :
تاریخ دفاع :
اساتید راهنما : سيدجواد سيدطبايي
اساتید مشاور :
اساتید داور :
مشاهده سایر پایان نامه های سيد جواد سيدطبايي
سابقه و هدف
توکسوپلاسماگوندی تک یاخته درون سلولی اجباری است که می‌تواند تمامی سلول‌های هسته دار مهره داران خون گرم و انسان را آلوده کند. هر چند آلودگی به این تک یاخته غالبا فاقد علایم بالینی است اما در برخی افراد مانند زنان باردار و بیماران دارای نقص سیستم ایمنی از اهمیت به سزایی برخوردار است. آزمون‌های سرولوژیکی متعددی برای تشخیص ایمنوگلوبین‌های اختصاصی ضد توکسوپلاسماگوندی به صورت تجاری موجود است اما نیاز به روش‌های بهتر و دقیق‌تر احساس می‌شود. در این مطالعه آنتی ژن نوترکیب GRA7 توکسوپلاسماگوندی برای تشخیص توکسوپلاسموزیس تهیه و در تست الایزا ارزیابی شد.
روش بررسی
بدین منظور ابتدا ترادف ژن کد کننده GRA7 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از طریق PCR تکثیر یافت. قطعه تکثیر یافته در وکتور pTZ57R و پس از آن در وکتور بیانی pGRX کلون گردید. ژن کلون شده در وکتور بیانی؛ با استفاده از IPTG به عنوان القا کننده بیان شد. جهت تایید بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب؛ الکتروفورز به روش SDS PAGE بر روی Lysate سلول‌های حاوی ژن بیان شده انجام گرفت و با انجام تست ایمونوبلاتینگ ارزشمند بودن پروتئین نوترکیب تولید شده مورد بررسی قرار گرفت. پس از القا و بیان آنتی ژن نوترکیب؛ پروتئین حاصل توسط ستون کروماتوگرافی GST تخلیص شد. مجددا فعالیت ایمونولوژیکی GRA7 نوترکیب با روش وسترن بلات و دات بلات مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت توانایی تشخیص ایمنوگلوبولین‌های ضد توکسوپلاسما recGRA7 با روش الایزا ارزیابی شد. ۷۲ نمونه سرم افراد سالم و مشکوک به توکسوپلاسموزیس در تست الایزای نوترکیب مورد آزمایش قرار گرفتند.
نتایج
با انجام sequencing مشخص گردید؛قطعه تکثیر شده تا ۹۷٪ هم خوانی با ترادف اولیه خود دارد. با انجام SDS PAGE بر روی Lysate باکتری‌هایE.coli BL 21 حاوی ژن بیان شده؛ تولید پروتئین نوترکیب با وزن مولکولی ۵۵ کیلودالتون به صورت Fusion Protein مورد تایید قرار گرفت. با انجام تست‌های ایمنوبلاتینگ و طراحی سیستم الایزا مشخص گردید پروتئین نوترکیب تولید شده با سرم بیماران مبتلا به توکسوپلاسموزیس واکنش اختصاصی می‌دهند.
بحث
گرانول‌های فشرده (GRA) اندامک‌های دفعی ترشحی هستند که در حفظ و بقای انگل در حفره پارازیتوفوروس اکثر سلول‌های هسته دار میزبان نقش دارند. در این پژوهش به بررسی جنبه‌های مفید مولکولی با استفاده از پروتئین GRA7 به عنوان آنتی‌ژن تشخیصی پرداخته شده است. بررسی فرم‌های نوترکیب آنتی ژن GRA7 در تحقیقاتی که قبلا انجام شده؛ نتایج مشابهی را نشان داده است.
در این تحقیق نیز آنتی ژنیک بودن پروتئین نوترکیب حاصل و توانایی واکنش آن با آنتی‌بادی‌های ضد توکسوپلاسما تایید شد.