سابقه و هدف: با توجه به مشكلات ناشي از ليشمانيا به عنوان يك انگل داخل سلولي بيماريزا كه بيش از 12 ميليون نفر را در بيش از 86 كشور جهان مبتلا نموده است و در راستاي ارزيابي توانايي گليكوپروتئين 63 كيلودالتوني (gp63) ليشمانيا ماژور به عنوان يك ايمنوژن در تحريك سيستم ايمني ميزبان و همچنين آنتي ژن تشخيصي، ژن كد كننده مولكول فوق در وكتور دو ميزبانه pHIL-S1 به منظور بيان آن ژن در مخمر متيلوتروف P.pastoris كلون و بيان گرديد و در نهايت خصوصيات مولكول نوتركيب حاصل نيز مورد ارزيابي قرار گرفت. مواد و روش ها: ژن تغيير يافته gp63 به گونه اي كه فقط پروتئين بالغ راكد نمايد، در وكتور دو ميزبانه (و همچنين پلاسميد puc19) كلون گرديد. مخمر Pichia pastoris (سويه هاي KM71 و GS115) با پلاسميد دو ميزبانه نوتركيب و همچنين با پلاسميد pHIL-s1 (به تنهايي) ترانسفورم گرديد. كلون هاي ترانسفورم شده در محيط فاقد هيستيدين انتخاب شدند، DNA كروموزومي ترانسفورمنت ها تخليص گرديد و با روش هاي PCR و S.B) Southern Blotting)، وارد شدن ژن فوق در كروموزوم مخمر نوتركيب مورد ارزيابي قرار گرفت. ترانسفورمنت هاي تاييد شده، در محيط حاوي گليسرول BMGY، تا حصول كدورت OD600=6 كشت و سپس جهت بيان ژن هترولوگ فوق به محيط حاوي متانول، BMMY، انتقال داده شدند. با افزودن متانول به صورت روزانه، حالت القا در آنان حفظ گرديد. با تخليص RAN و انجام N.B) Northern Blotting) صحت نسخه برداري و همچنين بيان ژن فوق (توليد پروتئين نوتركيب) با ژل 12% SDS-PAGE، وسترن بلاتينگ و IFA مورد ارزيابي قرار گرفت. ميكروسكوپ الكتروني و ايمونوالكترون ميكروسكپي براي تعيين محل داخل سلولي گليكوپروتئين هترولوگ rgp63، در مخمر بيان كننده ژن فوق مورد استفاده قرار گرفتند. فعاليت متالوپروتئيناز نوتركيب (rgp63) و همچنين تاثير بازدارنده هاي آنزيمي با SDS-PAGE gelatin مطالعه گرديد، توانايي مخمر در گليكوزيلاسيون متالوپروتئيناز نوتركيب (rgp63) نيز سنجش گرديد. يافته ها: PCR و (S.B) وارد شدن ژن gp63 را به گونه اي صحيح در كروموزوم مخمر نوتركيب تائيد كردند. (N.B) بر روي RNA تخليص شده از مخمر نوتركيب صحت نسخه برداري از ژن gp63، ژل 12% SDS-PAGE و وسترن بلاتينگ نيز، بيان ژن فوق (توليد پروتئين نوتركيب) را در مخمر ترانسفورمنت تائيد نمودند. مطالعه با SDS-PAGE gelatin gel، فعال بودن مولكول فوق را اثبات نمود. يدواستاميد و EDTA با غلظت 5 ميلي مولار از فعاليت اين مولكول در ژل مزبور ممانعت نمودند. بررسي ها با ميكروسكوپ الكتروني وجود ناحيه پروتئيني متراكم را در فضاي پريپلاسمي مخمر ترانسفورم شده با پلاسميد حاوي ژن نشان داد. بررسي هاي ايمونوالكترون ميكروسكوپي و IFA نيز تاييد نمودند كه ناحيه پروتئيني فوق، همان پروتئين نوتركيب (rgp63) مي باشد. آزمون PNGase-F نيز گليكوزيله بودن باندهاي بيش از 53 كيلودالتوني آن را اثبات نمود. نتيجه گيري: گليكوپروتئين 63 كيلودالتوني توليد شده در مخمر به فرم طبيعي خود بيشتر شباهت دارد، زيرا علاوه بر گليكوزيله بودن در SDS-PAGE gelatin gel نيز فعال مي باشد.
کلید واژگان :بيان ژن، ليشمانيا، مخمر، الكترون ميكروسكوپي، Pichia pastoris ،gp63
ارزش ریالی : 600000 ریال
با پرداخت الکترونیک